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  • lip2000脂质体2000的两种转染方法
  • 点击次数:5093 更新时间:2016-02-24
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  •    lip2000脂质体2000适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下zui方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。

      用lip2000脂质体2000进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者*的剂量,确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

      lip2000脂质体2000的转染方法常见有两种,具体如下:

      一、快速lip2000脂质体2000转染法操作步骤

      (1)将细胞以5 x 10^5个/孔接种于6孔板中培养24h,使其达到50%-60%板底面积。在试管中配制DNA-脂质体复合物。

      a、在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。

      b、旋转1s,再加入脂质体悬液,旋转。

      c、室温下放置5-10min,使DNA结合在脂质体上。

      (2)弃去细胞中的旧液,用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去,向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物,37℃培养3-5天。

      (3)再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,继续培养14-24h。

      (4)吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM,2ml/孔,再培养24-48h。

      (5)用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。

      二、稳定的lip2000脂质体2000转染法

      接种细胞同前述,细胞长至50%板底面积可用于转染。

      DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。

      在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM,37℃培养48h。

      吸出DMEM,用G418选择性培养基稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。

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