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  • Western 免疫印迹样品制备主要步骤及注意事项
  • 点击次数:1500 更新时间:2020-10-23
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  •   Western免疫印迹(WesternBlot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
     
      Western Blot 免疫印迹法样品制备主要步骤:
     
      原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白,以下为 定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。
     
      1、培养细胞或药物处理。
     
      2、弃培养基,用1X PBS漂洗细胞2次,去尽残留培养基。
     
      3、加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ,刮落细胞,转移到Ep管。注意:冰上操作。
     
      4、超声 10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
     
      5、煮沸样品5 minutes。
     
      6、离心12000g,5 min,取上清。
     
      7、电泳分离:上样15μl~20μl 至 SDS-PAGE 胶 (10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平, 应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150cm2 flask)裂解细胞, 收集裂解液至离心管中,在振荡器上混匀4~15min,14000g离心15min(4℃),弃沉淀,用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量,进行Western杂交时还需设置内或外参照,通常用beta-actin。
     
      注意:一般上样20~30 μg已足够,如待检蛋白为低丰度蛋白,可加大上样量 至100μg,但电泳条带易拖尾,可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。
     
      注意事项:
     
      1、操作中戴手套,不要用手触膜。
     
      2、PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
     
      3、如检测小于20kD的蛋白应用0.2μm的膜,并可省略转移时的平衡步骤。
     
      4、某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱,此时可用1.0% BSA代替Tween-20。
     
      5、关于封闭剂的选择:5%脱脂奶/TBSor PBS: 能和某些抗原相互作用,掩盖抗体结合能力;0.3~3% BSA in PBS:低的内源性交叉反应性。
     
      6、如用0. 1% Tween20、0.02% NaN3 in PBSor TBS作封闭剂和抗体稀释液,抗体检测后可进行蛋白染色。
     
      7、如要同时检测大分子量和小分子蛋白,*用梯度胶分离蛋白。
     
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