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  • RNA抽提技巧(TRIZOL法)
  • 点击次数:6120 更新时间:2016-08-18
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  •  为什么提取出的总RNA会降解?为什么OD260/280不在1.8-2.0之间?

    为什么。。。小伙伴们如果有这些疑问的话,不防往下看看到底是为什么。

    1、使用前防范:TRIzol剧毒且易挥发(由于主要成分是苯酚),lv仿呢也是一种有毒也易挥发的试剂,有的小盆友为了防止氧化,还会加入β巯基乙醇,这个反正建议有鼻子的童鞋都做好防护。提取RNA前做好保护措施,在通风厨中操作,所有接触TRIzol的耗材,扔到专门的密封的桶中,等待处理。否则整个实验室都会弥漫着气味!

    2、*前奏:所有耗材(枪头、EP管)均经过RNA酶灭活或者直接购买无RNA酶的耗材,除RNA酶主要方法是用DEPC水浸泡48小时(DEPC虽然味道香,但却是强致癌的,泡管子的时候别一直去闻它,一般来说煮沸或高温高压灭菌15min后,DEPC就会降解成二氧化碳和水),操作前戴口罩。

    3、RNA非常容易降解,所有步骤尽量在冰盒里面操作,包括离心时需用4度预冷的离心机。

    4、1-5×10^7细胞或者50-100mg组织加入1ml TRIzol,细胞或者组织过多,TRIzol过少会导致裂解不充分,内源性RNA酶抑制不*,导致RNA降解。

    5、TRIzol加入细胞后,反复吹打,充分裂解细胞至均一透亮,不粘稠为止。

    6、加入Lv仿后充分混匀,其实这步也不能过于剧烈,上层的水相含有RNA,中间的组织相含有DNA和蛋白质,剩余的一部分DNA会萃取到lv仿中,同时lv仿具有使蛋白质变性的作用,离心完,中间那层就是组织层。

    7、离心后,溶液分层,上层为含有RNA的水相,中间层乳白色的为含有部分DNA、蛋白质的组织层,下层红色的为含有DNA和部分蛋白质的lv仿, 此时,注意,“宁少勿多”,提取上层无色液体时,小心轻柔,可以用200ul的枪抽吸,特别注意:一般1ml的TRIzol时zui多可以提取500μl上清,但是建议提取400ul以下,千万避免吸到中间的乳白色组织层,否则zui后测量RNA时,OD260/280非常低,会有蛋白混入。

     

    8、异丙醇加入的目的是为了使RNA沉淀,此时RNA已经提出来了,应轻轻混匀,避免RNA损伤。离心后肉眼可见EP管底部白色羽毛状沉淀即为RNA沉淀。


    9、75%乙醇加入的目的是为了洗涤和沉淀作用,也应该轻柔。

    10、zui后乙醇应尽量充分挥干,先用枪头尽量把75%乙醇吸干,再晾5min,否则没有晾干乙醇,加入DEPC水时可能导致RNA白色沉淀不溶解。

    11、加入DEPC水溶解RNA时,可根据自己需要的浓度来调整加入DEPC水的量。

    12、RNA提取后可以跑琼脂糖胶来判断降解情况,纯的无降解的RNA跑完琼脂糖胶后应该有3条带,26S,18S, 5S。其中5S很淡,不容易看见。如果条带很淡,且有拖尾现象,提示有RNA降解。




     

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