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  • lip2000脂质体2000,让您对转染自信满满
  • 点击次数:59 发布时间:2017/9/12
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  •    lip2000脂质体2000,让您对转染自信满满
      lip2000脂质体2000是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞,提供高转染效率(表达转基因细胞的百分数)和活性(细胞抽提物中转入基因的酶产物活性)。
      特点 两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便:
      (1)DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中,有血清也不怕
      (2)转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂,无需换培养基
      操作流程 事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单:稀释DNA以及Lipofectamine 2000,混合2种稀释液保温20分钟,加入培养细胞中孵育24-96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
      转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板,lip2000脂质体2000使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清,不含抗生素的正常生长的培养基中。
      对于每孔细胞,使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA。
      对于每孔细胞,使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。) 注意:即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释,细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液,必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
      混合稀释的DNA(第2步)和稀释的lip2000脂质体2000(第3步)。在室温保温20分钟。
      注意:溶液可能会混浊,但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
      直接将复合物加入到每孔中,摇动培养板,轻轻混匀。
      注意:如果在无血清条件下转染,使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基,替换为0.5ml无血清培养基。
      在37℃,5%的CO2中保温24-48小时,无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
      在细胞中加入复合物24-72小时后,分析细胞抽提物或进行原位细胞染色,检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达,在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中,两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
      对于96孔板培养,不再需要提前一天进行细胞铺板,而可以直接在平板中制备复合物,然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了,这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H,293-F,COS-7L和CHO细胞的试验,同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得lip2000脂质体2000非常适用于96孔板的高通量转染,比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。
      适用细胞株范围 不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株,甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细胞株越多,当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen网站的资料,Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株,覆盖了相当广的范围。
      适用的核酸类型和DNA大小 有的转染试剂是为siRNA转染而设计的,有的则是为DNA转染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA,siRNA, dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染,这使得Lipofectamine 2000适用范围非常广泛,无论是基因表达分析的DNA转染,或者是RNAi,lip2000脂质体2000都能胜任,这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。值得注意的是,最常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题,太大的质粒不那么好转。我们暂时还没有找到Lipofectamine 2000相应的资料。
      注意事项 Lipofectamine 2000要求细胞铺板密度较高,以90%-95%为佳,这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofectamine 2000可用于有血清培养基的转染,并且转染前后不需要换培养基,使得操作方便了许多,但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂,因为血清会影响复合物的形成。复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lipofectamine 2000匹配,比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外还应该留意,如果你研究的基因要求比较长的表达时间,比如细胞周期相关基因,或者时细胞表面蛋白,最好选择细胞铺板密较低的转染试剂,不适合用lip2000脂质体2000
      对于大多数阳离子脂质体试剂,应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA和转染试剂的比例,通常推荐是1:2或者1:3,优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染,只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。
      还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素,比如青霉素和链霉素,一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染效率低。所以,在转染培养基中不能使用抗生素,甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样,在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外,lip2000脂质体2000为了保证无血清培养基中细胞的健康生长,使用比含血清培养基更少的抗生素量。
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