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  • 线粒体膜电位荧光探针操作步骤与注意事项说明
  • 点击次数:4434 更新时间:2020-08-21
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  •   线粒体膜电位荧光探针是一种广泛用于检测线粒体膜电△Ψm位的理想荧光探针。染料以电势依赖性的方式积聚在线粒体内,可以用来检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。正常线粒体内,聚集在线粒体基质中形成聚合物,聚合物发出强烈的红色荧光(Ex=585 nm, Em=590 nm);不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失,只能以单体的形式存在于胞浆中,产生绿色荧光(Ex=514 nm, Em=529 nm)。不仅可用于定性检测,因颜色的变化可以非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。也可以用于定量检测,因线粒体的去极化程度可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。观察时,只需使用常规的观察红色荧光和绿色荧光的设置即可。
     
      线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过线粒体膜电位荧光探针从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降,同时也可以用它从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。
     
      线粒体膜电位荧光探针使用方法:
     
      1. 工作液配制:
     
      1)粉末(5 mg):直接加1 mL DMSO到粉末内,室温颠倒混匀使其充分溶解,即得到5 mg/mL的储存液。溶液分装成小量储存于-20℃,避光干燥,避免反复冻融。
     
      2)储存液(1 mg in DMSO):本品是JC-1的DMSO储存液,浓度为5 mg/mL。使用者需要根据单次用量来分装,-20℃避光干燥,避免反复冻融。
     
      3)工作液配制:将冻存的储存液置于室温充分融化,之后用缓冲液或者预热的培养基直接稀释储存液(5 mg/mL)到需要的工作液浓度,边震荡边稀释,充分混匀。为了去除任何不溶颗粒,建议13,000 x g离心JC-1工作液1 min,小心吸取上清转移到新的管子内。整个过程要避光操作。注意:因JC-1不溶于水,很可能在稀释到工作液的过程中形成聚集颗粒,则建议细胞染色前用离心或者过滤的方法去除这些颗粒后再使用。
     
      2. 染色步骤(流式细胞仪)
     
      1)于6-,12或24-孔板上进行细胞铺板,密度为5×105 cells/mL。37℃,5%CO2培养箱培养过夜。选择合适的化合物根据特定的步骤进行凋亡诱导。 注:进行凋亡诱导时的细胞密度建议不超过1×106 cells/mL,也可根据自己的细胞类型培养至合适的密度。
     
      2)取0.5 mL细胞悬液至无菌的离心管内;
     
      3)室温条件400 x g离心5 min;吸掉上清。
     
      4)用0.5 mL JC-1工作液重悬细胞,于37℃,5%CO2培养箱孵育15-30 min;注意:一般情况,15 min足以进行充分的染色。
     
      5)室温条件400 x g离心5 min;吸掉上清;
     
      6)用2 mL细胞培养液或者缓冲液重悬细胞,之后室温条件400 x g离心5 min;吸掉上清;
     
      7)重复步骤6);
     
      8)用0.5 mL新鲜培养液或者缓冲液重悬细胞,即可进行后续的流式分析。注意:请马上进行流式定量分析,此细节很重要。
     
      数据分析:含有红色JC-1聚集物的健康细胞线粒体用FL2通道检测;含有绿色JC-1单体的凋亡或不健康细胞用FL1(FITC)通道检测。
     
      3. 染色步骤(荧光显微镜)
     
      A.悬浮细胞
     
      1)-6)同上JC-1染色步骤(流式细胞仪);
     
      7)用0.3 mL的缓冲液重悬细胞,即可进行荧光显微镜检测。注意:请马上进行荧光显微分析,此细节重要。
     
      B.贴壁细胞
     
      1)培养皿内用盖玻片进行细胞爬片或者细胞培养在腔室玻片(chamber slide)上。选择合适的化合物根据特定的步骤进行凋亡诱导。
     
      2)染色前开始配制工作液,配制步骤见上。
     
      3)吸掉细胞培养液,然后加入足够覆盖所有细胞的工作液。于37℃,5%CO2培养箱孵育15-30 min;注意:一般情况,15 min足以进行充分的染色。
     
      4)吸掉培养液,然后用合适的缓冲液来清洗细胞2次。
     
      5)加入2 mL细胞培养液(培养液可含有血清和酚红)或者PBS缓冲液,于荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察。数据分析同A. 悬浮细胞。
     
      注意事项:
     
      1)线粒体膜电位荧光探针是光敏感性的,所有染色步骤的操作过程中避免强光接触。
     
      2)染色完成后,立即进行后续的结果分析非常必要;
     
      3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
     
      4)本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗,食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。
     
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