荧光探针的作用用途：

　　常用于荧光免疫法中标记抗原或抗体，亦可用于微环境，如表面活性剂胶束、双分子膜、蛋白质活性位点等处微观特性的探测。通常要求探针的摩尔吸光系数大，荧光量子产率高；荧光发射波长处于长波且有较大的斯托克斯位移；用于免疫分析时，与抗原或抗体的结合不应影响它们的活性。

　　也可用于标记待定的核苷酸片断，用与特异性地、定量地检测核酸的量。

 

　　荧光探针的化学性质：

　　荧光定量PCR所使用的荧光化学制剂可分为两种：荧光探针和荧光染料。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成*同步。

　　实时荧光PCR技术靶基因的确定及引物和探针的设计原则

　　1、靶基因的确定：选择检测组共有的基因以避免检测的假阴性。

　　2、检测片段的确定：选择检测组内的保守(突变少)（避免假阴性）、组间特异的序列(突变多)（避免假阳性）作为引物探针的设计位置。片段长度70-150bp。

　　3、引物：长度17-25bp;GC含量30-80%；退火温度(Tm值)58-60℃；避免稳定的引物二聚体（特别是多联检测）及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m)；序列不能出现连续的G，3’端避免G或C，后5个碱基内避免两个以上的G或C。

　　4、探针：长度20-30bp（Taqman)或16-25bp(MGB)；GC含量30-80%；Tm值为68-70℃；避免稳定的二聚体及发夹结构(自由能大于-3.5kc/m)；5’端不能是G；位置尽量靠近上游引物；选择波长差异较大（多联检测）或Fam(单联检测）的荧光标记。